醛还原酶的原核表达、纯化及活性测定

作者：周小芬 王华倩 王真史 林卫萍 杜志云 张...醛还原酶原核表达非甾体抗炎药

摘要：醛还原酶(aldehyde reductase AKR1A1,EC1.1.1.2)是醛酮还原酶家族成员,能将有毒醛还原成相应的醇。构建含有组氨酸标签、肠激酶切位点与AKR1A1基因的原核重组表达载体p ET-22b-(His)6-DDDDKAKR1A1。将该质粒转化至Rosetta宿主菌中,通过对表达条件的优化,确定表达条件为0.25 mmol/L IPTG、16℃、80 r/min诱导14 h,重组蛋白以可溶形式表达。采用亲和纯化得到纯度为90%的pel B-(His)6-DDDDKAKR1A1融合蛋白。重组蛋白用肠激酶特异性剪切,经过Ni-NTA、Sephadex G-75再次纯化,得到纯度为98%的野生型AKR1A1蛋白。使用Western blotting和蛋白质序列分析对蛋白质进行鉴定。利用体外酶动学方法测定(His)6-DDDDK-AKR1A1的比活力为(41.3依0.1)U/mg、AKR1A1比活力为(79.4依0.15)U/mg。使用该蛋白建立醛还原酶抑制剂筛选方法,对已上市的13种非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)的抑制活性进行测定。结果表明奥沙普秦、酮基布洛芬、托芬那酸、氟灭酸等对AKR1A1有很高抑制作用。本研究表达纯化了高比活力的野生型醛还原酶,并应用该酶研究已上市的非甾体抗炎药对AKR1A1的抑制活性,所获得结果为非甾体抗炎药的副作用提供了参考。

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