作者：钱琤; 邓安梅; 陈孙孝; 王燕; 周晔; 陈燕...颗粒溶素基因表达外周血单个核细胞
摘要：目的构建人颗粒溶素（GNLY）质粒,进行原核表达,纯化得到相对分子质量9 000目的片段,免疫新西兰大白兔得到兔抗GNLY多克隆抗体。方法分离外周血单个核细胞,用卡介苗和白细胞介素-2（IL-2）刺激,培养12 d。抽提细胞RNA,通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）获得含有222 bp的GNLY cDNA,克隆到pMD18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a（＋）中,得到重组质粒pET28a（＋）-GNLY并将其转化大肠杆菌,诱导表达后用镍（Ni）亲和层析纯化,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹试验（Westernblot）进行鉴定。用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,得到抗-GNLY特异性多抗。结果成功构建了pET28a（＋）-GNLY表达质粒。用大肠杆菌表达带6个组氨酸的融合蛋白并进行纯化,最后免疫兔得到抗-GNLY特异性多抗,并经Western blot验证正确。结论获得了纯化的GNLY蛋白和抗-GNLY多抗血清,为今后对疾病中细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤（NK）细胞活性的研究打下了基础。
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