免疫磁珠分离联合荧光定量聚合酶链式反应快速检测阪崎肠杆菌的试验研究

作者：姚骅珊; 陈悦科免疫磁珠荧光定量pcr内参阪崎肠杆菌快速检测

摘要：建立免疫磁珠分离(Immunomagnetic Separation,简称“IMS”)联合荧光定量聚合酶链式反应PCR(Polymerase Chain Reaction,简称“PCR”)快速检测阪崎肠杆菌的方法。制备以生物素介导偶联的链霉亲和素免疫磁珠,优化偶联和捕获条件。合成阪崎肠杆菌ITS(Internal Transcribed Spacer简称“ITS”)靶基因序列的引物和探针,同时构建内参质粒(Internal Amplification Control,简称“IAC”),建立能够实时监控反应过程的荧光定量PCR反应体系。在1 mL体系中添加粒径为80 nm的链霉亲和素免疫磁珠0.3 mg,孵育30 min,可获得80.5%以上的捕获效率。建立的基于内参的荧光PCR体系针对质粒检测时,Ct值(Cycle threshold,简称“Ct值”)与模板拷贝数有着良好的线性关系(R2=0.998),IMS-PCR检测体系对阪崎肠杆菌菌液的检测灵敏度为33.3 CFU/mL,可在3 h内完成。针对4株阪崎肠杆菌标准菌株和5株非阪崎肠杆菌菌株的检测也显示出较好的特异性和稳定性,人工模拟样品的检测结果与采用国标法检测的结果完全一致,可用于快速检测样品中的阪崎肠杆菌和疾病预防。

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