人卵巢cDNA文库中与蛋白激酶Wee1B相互作用的候选分子的筛选及其调控作用

作者：刘超; 任丽莉; 栾治东; 孟智超; 刘乙蒙; ...蛋白激酶wee1b蛋白相互作用酵母双杂交小鼠受精卵

摘要：目的：利用酵母双杂交系统筛选与蛋白激酶Wee1B相互作用的新候选分子,并用生物信息学方法分析其与Wee1B相互作用是否能调控小鼠受精卵早期发育。方法：以pcDNA3.1/V5 His TOPO Wee1B WT质粒为模板构建pGBKT7Wee1B诱饵质粒;制备酵母感受态细胞,将诱饵质粒pGBKT7Wee1B转化酵母感受态细胞后分别接种SD/Trp（SDO）、SD/Trp/XαGal（SDO/X）和SD/Trp/XαGal/AbA plates（SDO/X/A）培养板检测其对酵母的毒性和自身激活能力,利用Western blotting法检测pGBKT7 Wee1B在酵母中的表达情况;将含有pGBKT7 Wee1B的酵母感受态细胞与人卵巢cDNA文库相融合,利用酵母双杂交系统筛选出阳性克隆,提取阳性克隆的酵母质粒转化大肠杆菌后进行测序鉴定,最终再经酵母重新转化验证。在GenBank中对其进行BLAST分析,根据基因注释推断其在小鼠受精卵发育过程中可能发挥的作用。结果：双酶切鉴定和测序分析,pGBKT7 Wee1B诱饵质粒构建成功。将该质粒转入酵母感受态细胞后在SDO/X/A平皿上无克隆。将pGBKT7Wee1B和pGBKT7空载体转入酵母感受态细胞中,菌液接种于SDO平皿,2个SDO平皿上克隆都均匀生长。从工作板SDO和阳性对照板上挑取阳性克隆扩大培养,裂解细胞提取蛋白,Western blotting法检测示pGBKT7Wee1B对应位置出现条带。含诱饵质粒的酵母菌与人卵巢cDNA文库融合,PCR验证融合后的阳性克隆质粒有插入片段。将质粒测序并经BLAST分析筛选出9个与Wee1B蛋白激酶存在相互作用的蛋白,生物信息学分析可能与小鼠卵母细胞发育和受精卵发育密切相关的蛋白。结论：利用酵母双杂交系统从人卵巢cDNA文库中筛选出9个与Wee1B蛋白激酶相互作用的蛋白,这些筛选蛋白可能通过与Wee1B相互作用调控小鼠卵母细胞成熟和受精卵早期发育。

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