作者：易军; 鲁茁壮; 段海峰; 王莉; 陈光辉; 王...腺病毒科鞘氨醇激酶突变体
摘要：目的制备携带人野生型鞘氨醇激酶基因(SPKwt)及其突变体(SPKDN)的腺病毒载体,为研究SPK的生物学功能提供高效基因转移载体.方法将野生型和突变体SPK基因亚克隆至穿梭载体pshuttle-cmv,重组的穿梭质粒经Pme Ⅰ线性化后,电转化E. coli BJ-AD-1感受态,获得带有目的基因的腺病毒重组子质粒;重组子经Pac Ⅰ线性化后,以脂质体介导转染293包装细胞,获得重组腺病毒载体;分别行PCR鉴定重组腺病毒是否携带目的基因,Western blot鉴定目的基因是否表达,酶活性检测判断野生型基因和突变体基因表达活性.结果重组腺病毒带有目的基因,可以感染内皮细胞并正确表达,酶活性分析表明野生型SPK基因增强SPK活性,突变体SPK基因抑制SPK活性.结论成功构建了携带SPK野生型及其突受体的重组腺病毒,为研究SPK的功能提供了物质基础.
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