作者：王春花; 成军; 闫惠平; 闫杰; 石英; 程胜...抑制性消减杂交克隆xtp3反式激活
摘要：目的应用抑制性消减杂交技术构建乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP3的差异表达的cDNA消减文库,克隆XTP3反式激活相关基因.方法以XTP3表达质粒pcDNA3.1(-)-XTP3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果文库扩增后得到30个白色克隆,经菌落PCR分析,得到23个200～1 000bp插入片段.对所得片段测序,并进行同源性分析,共得到20种已知基因序列和2种未知功能基因序列,可能是XTP3反式激活靶基因. 结论成功构建了乙型肝炎病毒XTP3反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定了基础.
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