作者：邱伟 程兴群 周学东 李雨庆牙龈卟啉单胞菌代谢基因表达纯化
摘要：目的克隆牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）中负责c-di-AMP代谢的相关基因,并使其在大肠杆菌中正确表达及高效纯化。方法通过聚合酶链反应（PCR）克隆牙龈卟啉单胞菌ATCC33277的pgn0523、pgn1187和pgn2003三个基因,经过酶切后将目的基因片段与大肠杆菌表达质粒p ET28a连接,分别构建出重组表达质粒p ETpgn0523、p ET-pgn1187和p ET-pgn2003。将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组蛋白,通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析和鉴定。用镍离子金属亲和层析法对重组蛋白进行分离纯化,BCA法检测目的蛋白的浓度。结果目的基因pgn0523、pgn1187和pgn2003扩增产物条带与预期大小一致。重组表达质粒p ET-pgn0523、p ET-pgn1187和p ET-pgn2003及其PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证与预期大小相符,测序结果与Gen Bank中牙龈卟啉单胞菌ATCC33277国际标准菌株的基因序列100%一致。IPTG诱导后的菌体经SDS-PAGE检测得到3个大小分别为19.5×103、39.9×103、66.0×103的蛋白质增强条带,与预期大小相符。镍离子金属亲和层析柱纯化得到的蛋白与预期目的蛋白分子量一致,BCA法测定目的蛋白的浓度分别为0.708、0.523和0.861 mg·m L-1。结论本研究成功克隆并表达纯化了牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP代谢相关蛋白,得到了较高浓度和纯度的目的蛋白,为进一步探究牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP的生理功能及体内代谢途径奠定了基础。
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