作者：王双双; 赵红梅; 周丹娜; 蔡行; 耿超日本乙型脑炎病毒ns3基因克隆真核表达转染bhk21细胞ifa
摘要：为了探讨日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)的复制机制及其蛋白与宿主蛋白的相互作用关系,试验以GenBank中收录的JEV HW1株NS3基因序列为模板设计引物,经PCR扩增获得NS3基因序列后,采用ClonExpress克隆技术将NS3基因连接到真核表达载体p EGFP-C3上,将得到的产物pEGFP-C3-NS3送生工生物工程(上海)股份有限公司测序;使用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent体外转染幼地鼠肾细胞(BHK21细胞),观察24 h后应用Western-blot和IFA法进行鉴定。结果表明:PCR克隆获得的基因片段大小约为1 370 bp,NS3基因片段与HW1株同源性为100%;BHK21细胞密度在70%~80%时质粒转染效果最佳,质粒质量与转染试剂体积的比例为1∶3;Western-blot鉴定融合蛋白成功表达,分子质量约为79 ku;IFA鉴定融合蛋白成功表达,24 h为转染高峰期,绿色荧光最强,pEGFP-C3-NS3与NS3阳性血清反应显红色荧光。说明在BHK21细胞中成功表达出NS3蛋白。
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