作者：耿超; 赵红梅; 周丹娜; 蔡行; 王双双日本乙型脑炎病毒ns5rdrp蛋白真核表达聚合酶链式反应bhk21细胞免疫印迹分析
摘要：为了探究日本乙型脑炎病毒( Japanese encephalitis virus,JEV)的复制机理和研制以 JEV 复制复合体为靶标的药物,试验以 GenBank 中收录的 JEV HW1 株基因序列为模板,设计针对 NS5rdrp 的特异性引物,提取 JEV RNA,反转录得到 cDNA,以其为模板使用 PCR方法克隆得到 NS5rdrp 基因片段;利用 T4DNA 连接酶构建重组质粒 pcDNA3. 1-NS5rdrp,并对产物测序;提取去除内毒素的重组质粒,用转染试剂 X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent 转染 BHK21 细胞,转染 24 h 后观察结果;最后利用 Western-blot 技术检测 NS5rarp 蛋白的表达情况。结果表明: PCR扩增得到大小约为920 bp的 NS5rdrp 基因片段;测序结果经 NCBI 上 BLAST 比对分析,克隆得到的 NS5rdrp 基因与 HW1 株的同源性为 100%;转染时细胞的最佳密度区间为 70%~ 80%,转染试剂与转染质粒的比例为 3 ∶ 1;经过Western-blot 检测,重组质粒在细胞内正常表达,NS5rdrp 蛋白的分子质量约为 37 ku。说明试验通过真核表达成功获得 NS5rdrp 蛋白。
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