作者：刘忠梅; 罗佳; 潘仲乐; 刘洪义; 李丹丹; ...番茄斑萎病毒双启动寡核苷酸引物检测
摘要：为了准确、高效地检出番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus, TSWV），利用双启动寡核苷酸引物（DPO）技术，以TSWV外壳蛋白（CP）基因为靶基因，设计了一对DPO引物，对PCR反应体系中的引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶用量进行优化，建立了TSWV的DPO-PCR检测方法，并对其灵敏度、特异性以及退火温度敏感性进行了评价。结果表明，应用DPO引物建立的PCR技术能够成功地扩增出TSWV的208 bp特异性条带，与预期目标相符。经过优化后，DPO-PCR反应体系（25 μL）为：DNA 模板1 μL，10×Buffer （含Mg^2＋ ） 2.5 μL，dNTPs（每种2.5 mmol/L）2.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，上、下游DPO引物（20 μmol/L）各1.0 μL，以去离子水补充至25 μL。利用该检测方法，在49.8～70.0 ℃的退火温度范围内，均可实现目标基因片段的高效扩增，说明其对退火温度不敏感；利用病毒RNA进行检测，该方法的灵敏度为7.5 ng；通过对TSWV、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒和番茄黑环病毒的检测表明，仅TSWV呈现阳性反应，说明该方法特异性强。所建立的DPO-PCR检测方法能够准确、高效地检测TSWV，可用于进出境种苗检疫筛查及田间病害诊断。
注：因版权方要求，不能公开全文，如需全文，请咨询杂志社
