作者：殷秀丽 刘平 金迪 赵秀梅 张丽娟 葛红岩bigh3定点诱变人角膜上皮细胞瞬时转染凋亡
摘要：目的对我国常见的BIGH3基因相关性人角膜营养不良的热点突变R124C进行体外定点诱变研究,并构建其真核表达载体,探讨其过表达对人角膜上皮细胞的影响。方法以pMD18-T/BIGH3载体为模板扩增野生型BIGH3基因全长编码序列,克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP上,采用快速体外定点诱变技术获得R124C突变体。瞬时转染体外培养的人角膜上皮细胞,免疫印迹检测野生与突变型BIGH3基因的表达,分别检测细胞培养基中TNF-α的含量,并收集细胞,分析caspase-3活性。结果 PCR成功扩增了野生型和R124C突变型的BIGH3基因,两种重组表达质粒转染人角膜上皮细胞后,免疫印迹检测结果证实其均在细胞中表达。细胞因子TNF-α分泌量增加,同时R124C型突变也可导致caspase-3酶活性增高。结论应用快速体外定点诱变技术,成功获得突变型R124C-BIGH3基因,转染人角膜上皮细胞后,通过caspase-3途径引起细胞凋亡,并上调分泌因子TNF-α。
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