作者：郝成伟; 李贺丹; 张献; 徐大庆谷氨酸棒状杆菌乳酰谷胱甘肽裂合酶基因表达酶活分析
摘要：乳酰谷胱甘肽裂合酶是生物体内降解丙酮醛的重要酶之一。食品级微生物谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组上的NCgl0106预测为乳酰谷胱甘肽裂合酶基因,但尚缺乏实验验证。本试验首先通过pCR技术扩增出预测的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032乳酰谷胱甘肽裂合酶基因lac,并将之与表达载体pET-28a连接,转化BL21(DE3)感受态细胞,成功获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-lac。然后,使用IpTG诱导E.coli BL21(DE3)/pET-28a-lac表达重组蛋白Lac。SDS-PAGE试验结果表明:重组Lac蛋白在大肠杆菌进行了可溶性表达,其分子量约为14 kDa。最后对重组Lac蛋白进行了分离纯化、活性检测及酶学特性分析。应用His-tag纯化获得的重组蛋白溶液浓度为604.9μg/mL;活性检测显示重组Lac蛋白能催化丙酮醛和谷胱甘肽生成S-D-乳酰谷胱甘肽,表明谷氨酸棒杆菌lac基因是乳酰谷胱甘肽裂合酶基因;酶学特性分析表明重组乳酰谷胱甘肽裂合酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为7,金属离子K+和Ca2+对其活性略有增强作用,Ba2+对酶活性几乎没有影响,Zn2+、Mg2+和Fe2+对酶活性有一定的抑制作用,Co2+和Mn2+几乎完全抑制其活性,酶反应米氏常数Km值为0.223 2 mmol/L,最大反应速率为0.025 mmol/(L·min)。
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