作者：张凯; 高珊; 朱树华肥城桃己糖激酶基因克隆生物信息学分析原核表达
摘要：为了深入研究己糖激酶（HK）的同工酶HKⅡ调控线粒体通透性转换孔（MPTP）的开放机理,通过RT-PCR技术和RACE技术,以克隆得到的肥城桃果实c DNA为模板,成功克隆得到HKⅡ基因全长,经原核表达和SDS-PAGE检测,体外构建原核表达载体pET-30a-HKⅡ,成功地在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达;使用镍柱纯化法,得到纯化的重组蛋白。克隆得到HKⅡ基因共1 835 bp,其中编码区1 496 bp,共编码497个氨基酸。HKⅡ蛋白预测分子式为C2379H3846N652O717S17,原子总数为7 611个,分子量为53.6 kDa,理论等电点为6.17,总平均疏水指数为0.023,表明HKⅡ蛋白为疏水性蛋白。TMHMM跨膜结构预测HKⅡ为跨膜蛋白,有1次跨膜,绝大部分在膜外。从二级结构预测结果来看,HKⅡ蛋白由15段α螺旋和11段β折叠和无规则卷曲构成。肥城桃HKⅡ蛋白预测的三级结构呈V字型,折叠结构较多。系统进化树和氨基酸相似性分析发现,桃果实HKⅡ与枇杷的相似度最高,达到了96.98%,桃果实HKⅡ与其他植物HK的氨基酸的同源性较高,说明HKⅡ具有较高的保守性。为进一步解析HKⅡ蛋白的结构和功能从而探讨HKⅡ调控线粒体MPTP的机理奠定了基础。
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