作者：兰金芝; 刘扬; 徐澍; 张金娟; 王欢; 肖俊...人乳头状瘤病毒基因芯片标准品质量控制基因克隆
摘要：目的：构建人乳头状瘤病毒（HPV）HPV26和HPV73亚型的单克隆标准品质粒,用于HPV基因芯片制备的质量控制。方法：收集HPV26和HPV73两种亚型感染的临床宫颈刮片脱落细胞样品,提取并PCR扩增样品中HPV的L1区DN段,琼脂糖凝胶电泳验证DNA分子量大小;利用基因克隆技术,将L1区DN段连接到线性化的p MD18-T质粒载体上,进行琼脂糖凝胶电泳验证质粒连接反应,将构建的HPV质粒转化进入大肠杆菌进行扩增,对质粒进行测序,验证插入DNA序列的正确性;PCR扩增HPV亚型单克隆质粒的L1区特异性DN段作为检测标准品,用该标准品与本课题组制备的HPV分型基因芯片进行杂交反应,显色和扫描成像,检测HPV26和HPV73位点的显色情况,从而评估基因芯片HPV26和HPV73探针的特异性和点样质量。结果：从感染HPV患者宫颈刮片脱落细胞成功提取HPV26和HPV73的DNA,并PCR扩增了L1区DNA,琼脂糖凝胶电泳显示扩增的DN段符合预期分子大小,将这些DN段连接到p MD18-T载体上,电泳结果显示连接后的质粒大小符合预期值,基因测序证实插入的HPV26和HPV73的DN段序列正确;PCR扩增了HPV26和HPV73单克隆质粒的L1区特异性DN段,电泳显示分子量大小符合预期值;杂交反应显示HPV26和HPV73探针特异性和重现性好,探针的灵敏度为100%,特异性为100%。结论：制备了的HPV26和HPV73的单克隆靶标DNA标准品,可用于HPV基因芯片的质控。
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