重组RNA干扰表达载体的构建与鉴定

作者：田宇 杜娟 李尚伟rna干扰稻纵卷叶螟海藻糖酶基因表达载体构建

摘要：干扰（RNA interference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。本研究以稻纵卷叶螟可溶型海藻糖酶基因（Cm Tre1）为靶标,设计RNAi靶位点并将其命名为Cm Tre1＊,在其两端分别添加Bam H I与Spe I酶切位点并进行人工合成,然后经双酶切后与p1301植物表达载体连接,构建重组表达载体p1301-Cm Tre1＊。PCR、双酶切和测序鉴定结果证明重组表达载体p1301-Cm Tre1＊构建成功,并将其成功转入农杆菌LBA4404,构建基因工程菌。用含有p1301-Cm Tre1＊质粒的农杆菌LBA4404浸染中花11号水稻的愈伤组织,经过愈伤组织的抗性筛选、分化和植株再生,获得26株阳性转基因植株。用取食非转基因水稻的稻纵卷叶螟作为对照,用实时荧光定量PCR方法分株测定取食转基因水稻稻纵卷叶螟体内Cm Tre1基因的mRNA表达水平,并检测其体内海藻糖酶活性变化。结果显示,相较于对照组,取食转基因水稻稻纵卷叶螟体内Cm Tre1基因表达量下降了44.79%,海藻糖酶活力平均下降了14.94%。研究结果表明转基因水稻的RNA干扰效应相当明显,能对取食其叶片的稻纵卷叶螟Cm Tre1基因起到明显的沉默作用。

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