作者：简兴 苗永美 隋益虎 边卓吾 陈存款 黄春...黄瓜赖氨酸脱羧酶烟草遗传转化
摘要：赖氨酸脱羧酶（LDC）催化赖氨酸脱羧形成尸胺。该研究采用RT-PCR技术从耐冷黄瓜‘Chipper’中分离到一段c DNA序列,利用DNAMAN6.0软件进行氨基酸序列分析,用BLASTp对蛋白的保守序列进行比对,用双酶切法和T4DNA连接酶构建了植物超表达载体p CAMBIA1304-LDC,通过在烟草不定芽诱导和生长培养基中添加不同浓度的潮霉素（Hyg）以确定不定芽分化和生长的筛选压力浓度,同时优化了菌液浓度、侵染时间和预、共培养时间4个农杆菌侵染条件。结果表明：该序列的CDS全长具有648 bp,编码216个氨基酸,BLASTp结果显示该蛋白具有赖氨酸脱羧酶的保守序列,认为分离到的序列为黄瓜LDC基因,在Gen Bank中的登录号是KC202438;当在叶块不定芽诱导培养基中添加10 mg·L^-1的Hyg时,芽诱导率明显降低,为5.41%;当芽生长培养基中的Hyg浓度为20 mg·L^-1时,芽苗成活率为33.33%,明显低于对照,因此认为10 mg·L^-1和20 mg·L^-1的Hyg浓度是抗性芽诱导和生长的筛选浓度;农杆菌侵染时,烟草叶盘不需要预培养,农杆菌OD600值为0.6,侵染5 min、共培养4 d时,侵染效果最好,能获得较高的抗性芽分化率。获得的抗性植株移栽成活后,叶片DNA经过PCR鉴定,获得了29株转化植株,转化率达93.55%。转化植株的获得为下一步基因功能分析提供了材料。
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