作者：韦方; 邓云坤; 乔慧vegf165转染表达293细胞蓝斑基因uc活性鉴定克隆人测序
摘要：目的克隆人VEGF165基因,构建其真核表达质粒,转染293细胞,并鉴定表达VEGF的生物学活性.方法采用PCR法从人心脏cDNA文库钓取人VEGF165基因,插入pUC19载体测序后与真核表达质粒pAdTrackCMV连接,阳离子脂质体Lipofectamin介导VEGF基因转染293细胞,Northern blot和Western blot法分别检测VEGFmRNA和蛋白的表达,Miles试验进行活性鉴定.结果(1)琼脂糖凝胶电泳分析得到两个片段,分别为582bp的VEGF165cDNA和2.68kb的pUC19线性质粒,结果与理论值相符,VEGF165测序结果与GENE BANK中VEGF165序列完全一致.(2)转染293细胞后表达绿色荧光蛋白,转染后第3天(1 024pg/ml)和5天(986pg/ml)VEGF表达最高,明显高于转染前(102pg/ml).(3)Miles试验结果显示,用转染AdTrackCMV-VEGF165细胞培养上清皮下注射后10分钟左右皮丘变为蓝色,成倍连续稀释后,出现蓝斑的时间延长,蓝斑范围也相应缩小.而注射未转染293细胞培养上清和生理盐水组则未见蓝斑出现.结论成功克隆人VEGF165基因,并表达出具有生物学活性的VEGF蛋白.
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