小鼠Calb2基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

作者：王菁 罗建 刘珊 代晓南 高莉 高超 刘嘉茵...calb2基因腺病毒科遗传载体泌尿生殖系统

摘要：目的：为了体外研究Calretinin（Calb2）基因在生殖系统、神经系统、视觉传导中的作用，构建小鼠Calb2基因表达重组腺病毒载体。方法：用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）方法，以小鼠Calb。eDNA为模板，扩增Calb2基因。亚克隆后，将Calb2基因片段克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTraek—CMV上，构建穿梭质粒pAdTrack—Calb2。将穿梭质粒pAdtraek—cozb2转化至BJ-5183感受态细菌中，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组，获得重组质粒LAdCMV—Calb2。重组质粒AdCMV-例6精染AD-293细胞，进行病毒包装和扩增，通过绿色荧光蛋白（GFP）报告基因观察重组病毒的产生。同时，构建对照腺病毒载体AdCMV—GFP。用获得的重组腺病毒感染AD-293细胞，通过观察GFP检测感染效率、蛋白质印迹方法检测CaZb2基因的表达。结果：测序和酶切鉴定重组腺病毒质粒构建正确；经AD-293细胞包装后可观察到GFP表达；获得的重组腺病毒载体体外感染AD-293细胞，观察到GFP表达；经蛋白质印迹方法检测，与未感染腺病毒载体组（Mock）和感染对照腺病毒载体组（AdcMV）相比，Calb2基因腺病毒载体（AdCMV—Calb2）感染组CALB2蛋白水平显著增高（P〈0．05）。结论：成功构建了小鼠Calb2基因重组腺病毒载体，并在AD-293细胞超表达，为课题组研究Calb2基因在生殖相关疾病的生理与病理生理作用奠定了基础。

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