作者：何国平; 张思仲; 马用信; 肖翠英; 许文明...短发夹rna介导egfp转染蛋白表达实验抑制rna干涉碱基错配细胞
摘要：采用载体介导的RNA干涉 (RNA interference,RNAi)技术抑制HEK293H细胞中外源报告基因的表达,并设置一系列的实验学控制以探讨其在RNAi应用研究中的价值及意义.运用pAVU6+27,构建了针对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的一系列短发夹RNA表达载体,并用脂质体法转染于HEK293H细胞中,检测EGFP mRNA及蛋白表达水平.瞬时转染48h后, RT-PCR及Western blot结果表明,针对EGFP三个靶点的干涉质粒均不同程度地抑制细胞内EGFP的表达,但仅转录正反义链、链内1-2个碱基错配的干涉载体不能介导特异的RNAi效应.此外,共转染实验结果表明干涉质粒两两间无相互增强或抑制的RNAi效应.在此基础上,通过G418筛选生成了HEK293H EGFP稳定表达株,在转染后不同时间点检测EGFP mRNA及蛋白表达变化,发现RNAi 效应在一定时间范围内呈现明显的时间依赖性.这些结果表明,有效的实验控制在RNAi研究中十分必要,具有重要的参考价值.基于载体表达的RNAi作用呈现明显的时间依赖性效应,为RNAi应用研究提供了一定的参考及借鉴价值.
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