作者：潘贤辉; 刘奕; 周康奇; 胡隐昌; 郑曙明; ...双须骨舌鱼卵黄蛋白原克隆组织表达原核表达
摘要：为探究双须骨舌鱼（Osteoglossum bicirrhosum）卵黄蛋白原vtg基因的结构和表达特征,本研究运用RACE技术克隆双须骨舌鱼vtg全长c DNA序列。序列分析发现,双须骨舌鱼vtg的c DNA全长为5 325 bp,开放阅读框（ORF）为5 121 bp,其5′和3′非编码区（UTR）分别为46 bp和159 bp,共编码1 706个氨基酸,预测蛋白质分子量约为186.79 ku。同源性分析发现,双须骨舌鱼与同科的美丽仆骨舌鱼（Scleropages formosus）相似度达到84.78%,与鲤形目、鲈形目、鲱形目、鲽形目鱼类的相似度均高于50%。系统进化树分析结果显示,本文获得的双须骨舌鱼vtg基因与骨舌鱼目聚为一类,与鳗鲡目硬骨鱼类亲缘关系较近,与双须骨舌鱼进化地位相符。荧光定量PCR检测结果表明,在雌雄鱼性腺和肝中vtg均有表达,且在雌鱼肝中的相对表达量显著高雄鱼（P〈0.05）,卵巢和精巢表达量无显著差异（P〉0.05）;在雌雄鱼鳃、脾、肾、肌肉、心、头肾、脑等7个组织中均极微量表达,且无显著差异（P〉0.05）。在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期卵巢中vtg相对表达量依次增加,Ⅳ期显著高于Ⅱ和Ⅲ期（P〈0.05）,也显著高于精巢Ⅳ期（P〈0.05）;在雌鱼肝组织中呈先增后减趋势,且Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期之间无显著差异（P〉0.05）,但每个时期都显著高于雄性（P〈0.05）。成功构建了原核表达载体p EASY-Blunt E2-vtg,并转入Transetta（DE3）表达感受态细胞中成功诱导出融合蛋白。Western-blotting检测显示,融合蛋白可被抗His标签特异性识别。综上表明,vtg表达水平高低与性别相关,并与性腺发育程度有关。此外,本研究结果也为后续深入研究卵黄蛋白原的生理功能打下基础。
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