作者：徐铮; 曹永兵; 高平挥; 张军东; 曹颖瑛; ...全长cdna文库白念珠菌抗药性smart
摘要：目的:为克隆和研究白念珠菌新耐药相关基因,应用SMART(switching mechanism at 5'end of RNA transcript)技术,快速构建高质量的白念珠菌全长cDNA文库.方法:采用TRIzol试剂提取不同生长期、不同药物刺激的白念珠菌SC5314的总RNA,经Oligotex试剂盒纯化得到mRNA.利用含Sfi Ⅰ B酶切位点的CDSⅢ/3'PCR引物合成cDNA第1条链,而含SfiⅠA酶切位点的SMART寡核苷酸作为cDNA第1条链在mRNA 5'端延伸出去的模板.LD-PCR合成双链cDNA,经SfiⅠ酶切和过柱分级分离后,与pBSF质粒进行连接,随后转化大肠杆菌,构建成全长cDNA文库.测序验证部分插入cDNA的全序列,计算全长性比例.结果:构建好的文库中含有约1.1×106的重组子,重组率为97.6%,插入cDNA长度为750～3000bp,且大部分在1.5kb以上.测定60个克隆的全序列,经生物信息学分析,全长性比例在50%以上.结论:成功构建了白念珠菌全长cDNA文库,为进一步筛选、克隆白念珠菌耐药相关基因奠定了基础.
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