作者：牛虹博; 胡鹏; 程鹏丽; 储旭; 胡春兰; 陈...双特异性磷酸酶慢病毒shrnazf4细胞凋亡低温胁迫
摘要：为了研究双特异性磷酸酶（dual-specificity phosphatase 1,dusp1）基因与鱼类低温诱导的细胞凋亡之间的关系,本研究经Eco RI和Age1酶切构建plko.1-dusp1-sh RNA1,plko.1-dusp1-shRNA2,plko.1-negative control（nc）,plko.1-EGFP的重组质粒,并分别与慢病毒包装质粒pCMV-DR8.9.1、pCMV-VSVG共同转染至293T细胞中,经293T细胞包装的病毒,感染斑马鱼（Danio rerio）胚胎成纤维样细胞（zebrafish embryos fibroblast like cell line,ZF4）,RT-PCR检测表明dusp1成功被敲降。经嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞系,将细胞于28℃培养（正常对照组）或经10℃低温处理10 d,使用annexin V-FITC/Propidium lodide（PI）双色标记流式细胞术检测ZF4细胞凋亡情况。结果显示：低温胁迫下dusp1敲降的细胞凋亡（dusp1-shRNA1敲降,dusp1-kd1;dusp1-shRNA2敲降,dusp1-kd2）比例较nc组显著上调,其中早期凋亡和晚期凋亡细胞比例dusp1-kd1显著高于nc组,并且dusp1-kd1活细胞数显著低于nc组（P〈0.05）,进一步证明dusp1参与鱼类冷应激过程,并在低温情况下保护细胞。该研究为后期对斑马鱼细胞低温胁迫实验奠定了基础,其中dusp1基因沉默型斑马鱼细胞在10℃低温处理10 d凋亡数显著大于对照组,证明dusp1在细胞凋亡信号通路中起到重要调控作用,为低温下研究斑马鱼基因的分子机制提供新的思路。
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