作者:焦平; 马杰; 王文加; 王建秋; 王丁丁; 张...cho细胞稳定转染
摘要:目的 在CHO细胞中稳定表达人分泌型Klotho(hsKL)蛋白,制备具有天然结构的重组hsKL(rhsKL)蛋白。方法 用PCR法自克隆载体pBS—hsk1中克隆hsKL DNA,构建真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)-hskl。经核酸测序确证后,阳离子聚合物转染CHO细胞。用PCR法筛选具有Zeocin抗性的阳性细胞克隆,SDS—PAGE(银染色)法确定CHO细胞分泌蛋白的分子量,Western印记法鉴定CHO细胞的培养上清液中的rhsKL蛋白,确定稳定转染细胞株CHO—hsKL。结果 经PCR法克隆的序列与Gene Bank登录的bskl mRNA序列一致。将hsKL DNA定向插入pcDNA3.1/Zeo(+),构建pcDNA3.1/Zeo(+).hsk1真核表达载体并通过阳离子聚合物转染CHO细胞获得Zeocin抗性的转染阳性克隆。SDS—PAGE和Western blot分析显示,转染的CHO培养上清中含有分子量约为66kDa的rhsKL蛋白。结论 首次实现天然结构的hsKL蛋白的重组表达——获得稳定表达细胞株CHO—hsKL。
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