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粉尘螨变应原Derf8全长基因克隆及表达

作者:王楠; 滕飞翔; 俞黎黎; 杨李; 张承伯; 周...粉尘螨变应原基因克隆基因表达生物信息学

摘要:目的获得粉尘螨(Dermatophagoides farinae)变应原Derf8全长基因并构建其原核表达质粒。方法参考GenBank登录号为AY283295的Derf8部分序列设计并合成引物。以粉尘螨总RNA为模板.RT—PCR扩增获得Derf8部分片段。采用5’cDNA末端快速扩增技术frapid amplification of cDNAends,RACE)获得Derf8全长序列,连接至pMD19-T载体,热转化至大肠埃希菌(Escherichia coli),挑取阳性菌落,抽提质粒后测序。根据Derf8全长序列设计并合成引物,以粉尘螨总RNA为模板进行RT—PCR扩增,产物回收后连接pCold TF载体,热转化至E.coli,涂板过夜培养后,挑取阳性菌落,抽提质粒后测序。将pCold TF-Derf8质粒转化至E.co托BL21,异丙基-β—D-硫代半乳糖苷诱导表达,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)分析表达产物。采用生物信息学软件预测Derf8的理化特性、结构和功能.并构建系统进化树。结果以Derf8部分序列设计的引物行RT-PCR扩增获得Derf8部分片段,长度为600bp;5’RACE获得Derf8剩余序列,长度为300bp;以全长基因序列设计的引物进行RT—PCR扩增获得了Derf8基因CDS区,长度为696bp,测序均正确。SDS—PAGE结果显示,目的蛋白为可溶性表达,相对分子质量(麒)为81000.与预期大小一致。序列经生物信息学分析结果显示,Derf8全长序列与参考序列(GenBank登录号为AY283295)同源性为98.49%.预测其编码的疏水性蛋白具有谷胱甘肽S转移酶活性,二级结构包括α-螺旋(45.45%)、延伸主链(11.26%)和无规卷曲(43.29%)。系统进化树结果显示,粉尘螨与户尘螨(Dermatophagoidespt eronyssinus)聚成一簇。结论获得了Derf8全长基因及其原核表达质粒。

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中国寄生虫学与寄生虫病

《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》(CN:31-1248/R)是一本有较高学术价值的大型双月刊,自创刊以来,选题新奇而不失报道广度,服务大众而不失理论高度。颇受业界和广大读者的关注和好评。 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》为寄生虫学与寄生虫病专业学术期刊,主要报道有关人体寄生虫学与寄生虫病的科研成果和防治经验,介绍新理论、新技术和新进展,促进国内外学术交流,推动科研和防治工作的发展。

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