细粒棘球绦虫转醛醇酶基因的克隆、表达及其潜在免疫诊断价值的研究

作者：辛奇; 景涛; 宋晓霞; 高海军; 孙旭东; 吕...细粒棘球绦虫转醛醇酶基因克隆表达免疫诊断药物靶点

摘要：目的对细粒棘球绦虫转醛醇酶（Echinococcus granulosus transaldolase，EgRAL）编码基因进行生物信息学分析、克隆和表达，并对其作为药物靶标及其潜在的免疫诊断价值进行初步评价。方法运用多种软件分析EgTAL的理化性质、保守功能域、同源性和三级结构等。从重组质粒pBluescript Ⅱ SK翰耐中PCR扩增Eutd基因，克隆至pET30a，构建表达载体pET30a-Egtal，转化大肠埃希菌（Escherichia coli）BL21（DE3），异丙基-β—D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表达产物，抗His标签镍亲和层析柱纯化重组蛋白EgTAL，与细粒棘球蚴病患者血清进行蛋白质印迹（Western blotting）分析。用20份已确诊的细粒棘球蚴病患者血清和20份健康者血清，ELISA法评价重组蛋白EgTAL的免疫诊断效果。分光光度法检测重组蛋白EgTAL的酶活性。结果Egtal基因长981bp，编码的蛋白含326个氨基酸．理论相对分子质量（尬）为36332，等电点为5．11，含TAL标识序列DATTNPSLI（31-39aa）及酶活性催化部位，EgTAL与人TAL的同源性为62％。三级结构分子建模显示，EgTAL具有A和B两条完整的蛋白链。成功构建重组质粒pET30a—Egtd。SDS—PAGE和Westernblotting分析结果显示．重组蛋白EgTAL在E．coliBL21（DE31中获得高效表达，在尬36332处可见重组蛋白EgTAL条带，主要以可溶性形式存在，EgTAL可被细粒棘球蚴病患者血清识别。ELISA分析结果显示，20份细粒棘球蚴病患者血清和20份健康者血清的平均A450值分别为1．189±0．384和0．325±0．078，其中17份细粒棘球蚴病患者血清检测结果为阳性。酶活性检测结果显示．纯化后的EgTAL具有高效酶活性，60μgEgTAL加入酶促反应体系催化反应30min后，体系的吸光度（A340值）由1．684±0．103降至0．139±0．009。结论克隆了细粒棘球绦虫Egta／基因，并在E．coliBL21�

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