恶性疟原虫二氢乳清酸脱氢酶抑制剂体外诱导恶性疟原虫耐药的实验研究

作者：周洪昌; 张慧; 李小余; 郭跃; 姚韵靓; 王...恶性疟原虫二氢乳清酸脱氢酶抑制剂耐药

摘要：目的分析恶性疟原虫二氢乳清酸脱氢酶（Plasmodium falciparum dihydroorotate dehydrogenase，PfDHODH）抑制剂（二氢噻吩酮类化合物，编号50，以下简称PJDHODH抑制剂50）对体外培养恶性疟原虫的作用特点及其诱导耐药的可能机制。方法恶性疟原虫氯喹敏感株（3D7株）和氯喹抗性株（Dd2株）同步化培养后分为不加药对照组、环状体期加药组和大滋养体期加药组．药物终浓度为80nmol／L。分别在同步化后0h（环状体期）、24h（大滋养体期）、42h涂薄血膜片镜检；通过逐步加大药物浓度的方法，体外诱导产生耐药虫株．3个月后经有限稀释培养．获得单克隆耐药虫株。采用SYBRGreenI染料法检测各耐药虫株对PJDHODH抑制剂50、氯喹和青蒿素的半数抑制浓度（IC50）；PCR扩增各耐药虫株矸妣odh基因并测序，分析其突变情况。结果与不加药对照组相比．环状体期加药组恶性疟原虫从滋养体到裂殖体的发育受到明显抑制．大滋养体期加药组恶性疟原虫呈现明显的空泡化，核质密度大大降低。通过体外诱导并经有限稀释培养，获得44株PfDHODH抑制剂50的单克隆耐药虫株．其中，母本为Dd2、3D7的耐药虫株分别为24和20株，它们对PfDHODH抑制剂50的IC50分别为（2．284±0．096）和（0．678±0．018）μmol／L，较母本虫株的（0．018±0．002）和（0．015±0．002）μmol／L分别提高了近130倍和50倍；对氯喹和青蒿素的IC50分别为（0．011±0．002）、（0．014±0．004）和（0．013±0．003）、（0．012±0．001）μmol／L；与母本Dd2虫株相比，Dd2耐药虫株对氯喹的IC50从（0．072±0．002）μmol／L下降为（0．011±0．002）μmol／L。测序分析结果显示，23株Dd2来源的耐药虫株PfDHODH蛋白氨基酸序列发生了G181D的点突变．另有1株除G181D的点突变外．还产生了K32N的点突变：3D7来源的耐药虫株未发现相应突变。结论体外诱导获

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