利用sgRNA串联表达框架编辑恶性疟原虫K13和NUP116基因的研究

作者：孟令文; 赵月蒙; 夏惠; 方强; 张青锋恶性疟原虫基因编辑

摘要：目的 利用单链引导RNA（sgRNA）串联表达框架编辑恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）K13和NUP116基因。 方法 根据恶性疟原虫K13和NUP116基因序列设计引物，PCR扩增K13和NUP116基因的同源臂，并引入突变位点。PCR串联基因K13和NUP116的sgRNA，将同源臂和串联的sgRNA与载体pL6cs连接，构建用于电击转染实验的载体pL6-K13-NUP116，将其与表达Cas9蛋白的质粒一同通过电击转染法，转入恶性疟原虫体内，利用成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9（CRISPR/Cas9）系统对基因进行编辑修饰，通过筛选药物二氢叶酸还原酶抑制剂（WR）和杀稻瘟菌素（BSD）筛选转基因疟原虫，提取转基因疟原虫的基因组，对其进行PCR检测，最终通过测序鉴定K13和NUP116基因是否成功被突变修饰。 结果 PCR扩增出K13和NUP116串联的同源臂（K13全长557 bp，NUP116全长569 bp）以及串联的sgRNA，与载体pL6cs连接后成功获得用于电击转染实验的表达载体pL6-K13-NUP116。电击转染后通过药物筛选转基因疟原虫，培养至第28天涂片镜检发现疟原虫。PCR检测结果显示，转基因疟原虫K13和NUP116基因突变修饰成功。测序表明，K13和NUP116基因的目标位点被成功突变。 结论 基于CRISPR/Cas9编辑技术的串联sgRNA表达载体可同时对恶性疟原虫K13和NUP116基因进行编辑。

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