美洲钩虫蛋白酶抑制剂NaKuI1对蛋白酶的抑制作用的鉴定和特性研究

作者：隋细香; 邵正; 蒋琦; 周叶; 何庆丰; 司徒...美洲钩虫kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂原核表达胰蛋白酶纤溶酶

摘要：目的 分离美洲钩虫（Necator americanus）Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂1（NaKuI1）cDNA，并进行原核表达，研究其抑制蛋白酶的效果。 方法 根据GenBank上预测的不完整的NaKuI基因序列（XM_013449790）设计引物，运用快速扩增cDNA末端技术（SMART-RACE）分别从美洲钩虫成虫cDNA中扩增NaKuI1 cDNA的5′和3′末端序列，拼接获得全长NaKuI1 cDNA。将NaKuI1成熟肽编码基因连接入原核表达载体，构建重组质粒pET32a-sumo/NaKuI1，转化至大肠埃希菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导NaKuI1融合蛋白表达。表达产物包涵体经变性、复性、Ni-NTA亲和层析纯化后，用SUMO蛋白酶切割融合蛋白标签后获得重组蛋白rNaKuI1。用凝血时间法检测rNaKuI1的抗凝活性，发色底物法检测其对人纤溶酶、胰蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和蛋白酶3、猪胰蛋白酶和胰弹性蛋白酶及牛α-胰糜蛋白酶的抑制作用。 结果 获得NaKuI1全长cDNA，其编码的多肽由84个氨基酸残基组成，其中含16个氨基酸残基组成的信号肽，68个氨基酸残基组成的成熟肽。成熟肽原核表达产物为不可溶的包涵体。经变性、复性后纯化的rNaKuI1无抗凝血活性。在100倍摩尔浓度比下，rNaKuI1对人纤溶酶（5 nmol/L）、人胰蛋白酶（1 nmol/L）和猪胰蛋白酶（5 nmol/L）活性的抑制率近100%，对牛α-胰糜蛋白酶（1 nmol/L）和人中性粒细胞弹性蛋白酶（5 nmol/L）活性的抑制率分别约31.45%和25.18%，对人组织蛋白酶G、蛋白酶3和猪胰弹性蛋白酶均无抑制作用。rNaKuI1抑制人胰蛋白酶及纤溶酶的抑制常数（ki）分别为（21.17 ± 7.22）和（21.72 ± 3.95）nmol/L。 结论 成功分离获得NaKuI1全长cDNA序列，其原核表达产物rNaKuI1具有较强抑制胰蛋白酶和纤溶酶活性的特点。

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