作者：李睿; 黄菲菲; 陆利; 赵云鹤神经干细胞慢病毒基因沉默增殖分化小鼠
摘要：目的：优化20S蛋白酶体β5亚单位（proteasome subunit beta type-5,PSMB5）-shRNA慢病毒感染神经干细胞（neural stem cells,NSCs）的方案,观察PSMB5表达下调对NSCs增殖和分化能力的影响,探讨调控NSCs潜能的分子机制。方法：构建携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因的PSMB5-shRNA慢病毒载体,并设错义序列对照,感染新生小鼠（postnatal day 0,P0）NSCs。倒置荧光显微镜观察GFP阳性率,计算感染率,RT-PCR、免疫印迹和荧光分光光度法检测PSMB5沉默效率和蛋白酶体活性。比较对照组和shRNA组神经球的数量和直径,利用CCK-8实验观察PSMB5基因沉默对NSCs增殖潜能的影响。Tuj1染色观察PSMB5基因沉默对NSCs分化能力的影响。结果：PSMB5-shRNA慢病毒感染NSCs 24 h后可见GFP荧光表达,48 h达峰值,传代后可见GFP稳定表达。其感染复数MOI为40,polybrene 3μg/ml时,感染48 h GFP阳性率可达92.5%±2.3%;PSMB5-shRNA组PSMB5 mRNA和蛋白表达水平分别较对照组降低66.49%±4.81%（P〈0.001）和33.1%±2.54%（P〈0.001）。PSMB5-shRNA组蛋白酶体活性较对照组下降43.4%±1.48%（P〈0.01）。shRNA组NSCs的增殖能力降低,神经球数量为126.5±8.4显著低于对照组163.5±9.5（P〈0.01）,神经球的平均直径为29.9μm±2.6μm显著低于对照组42.9μm±2.3μm（P〈0.01）。CCK-8结果表明PSMB5-shRNA组细胞吸光度值0.36±0.04,显著低于对照组0.59±0.03（P〈0.001）,PSMB5-shRNA组Tuj1＋阳性率为39.13%±8.14%,较对照组显著降低（P〈0.01）。结论：PSMB5基因沉默可降低NSCs蛋白酶体活性抑制P0期小鼠NSCs增殖分化能力。
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