作者：唐雨婷; 高景波; 龙川; 杜敏杰; 黄林华; ...4基因敲除猪异种移植排斥反应
摘要：猪（Sus scrofa）β1,4 N-乙酰半乳糖胺转移酶（β1,4 N-acetylgalactosaminyl transferase,β4GalNT2）及其产物是引起异种移植排斥反应的重要非半乳糖（Gal）抗原之一。为了进一步降低异种移植排斥反应,本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因（α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1）敲除的巴马小型猪基础上,利用规律成簇间隔短回文重复/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9）技术制备β4GalNT2基因敲除猪。首先设计靶向猪β4GalNT2基因的单链导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,构建sgRNA表达载体,将其电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞,进行单细胞培养,采用PCR、TA克隆及测序的方法鉴定单细胞克隆的突变类型。选择β4GalNT2基因突变的单细胞克隆为核供体,通过体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer,SCNT）技术制备β4GalNT2基因敲除猪,利用上述鉴定单细胞克隆突变类型的方法对仔猪β4GalNT2基因突变类型进行鉴定。分离仔猪外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,与异硫氰酸荧光素标记的双花扁豆凝集素（fluorescein isothiocyanate conjugated Dolichos biflorus agglutinin,FITC-DBA）共孵育,检测仔猪β4GalNT2的表达。使用软件Optimized CRISPR Design预测sgRNA的潜在脱靶位点,PCR产物测序进行脱靶检测。结果显示,单细胞培养获得的25个β4GalNT2单细胞克隆中有14个发生基因突变。克隆胚胎移植2头受体母猪,其中1头妊娠至终期并产仔猪1头,仔猪β4GalNT2基因突变类型为-6 bp/-13 bp/WT。仔猪PBMC与FITC-DBA共孵育无绿色荧光,表明仔猪β4GalNT2基因已失活。脱靶分析结果显示,β4GalNT2基因敲除仔猪的sgRNA潜在脱靶位点均未发生突变。总之,本研究利用CRISPR/Cas9技术在国内首次成功制备了GGTA1/β4GalNT2基因敲除猪,有望减轻异种移植抗体介导排斥反应,为临床器官移植的应用研究提供了良好的研究材料。
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